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新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

作者: 发布时间:2020-01-05 10:57:06 阅读: 43 次

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新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

 

摘要】目的:研究新型阳离子核酸载体的细胞转染效率。方法:运用MTT比色法对DNA和LW13-2不同比例下的细胞毒性进行分析;在荧光显微镜下对转染效率进行计算。结果:LW13-2细胞存活率会伴随着DNA比例的增加而降低。DNA在转染复合物中的含量较少,DNA和LW13-2质量比为1:1、2:1、3:1,细胞存活率均在90%以上;当DNA:LW13-2为1:3时,转染率更高能够达到88.6%。转染率下降,DNA:LW13-2为1:56,促使大量细胞破碎和死亡。结论:将新型的阳离子脂质体核酸载体LW13-2应用到体外核酸转染中,展现出了较强的优势,为后续的基因治疗研究工作提供了载体系统。

【关键词】细胞转染;阳离子;核酸载体

 

    阳离子核酸载体作为基因治疗中一项新型的治疗技术,通过将适宜的载体导入到靶细胞中,有助于确保基因的持续性和稳定性。核酸传递载体自身具有较强的应用价值,其在实际的使用过程中,展现出了较强的治疗效果及治疗质量,是一种关键性的治疗因素,通过与各种材料及基团有机的组合在一起,形成一种新型的核酸载体,被广泛应用于医学领域中,成为医学行业的热点研究问题。本文将新型核酸载体材料LW13-2作为主要的研究对象,重点对细胞毒性及转染效率进行研究,探讨其在细胞转染效率中的应用情况。

1资料及方法

1.1  一般材料

1.1.1实验材料

    新型核酸载体材料LW13-2作为本次实验的主体材料,该材料在实验中保存,在大肠杆菌DH5中扩增,QIAgene质粒主要是从试剂盒中提取出来,在0.22微孔来完成除菌,放在-20℃下进行保存。所有的细胞均使用10%胎牛血清的DMEM进行培养。

1.1.2实验仪器

    CO2培养箱、酶标仪、倒置荧光显微镜、超净工作台。

1.2  方法

1.2.1LW13-2细胞毒性测定

运用LW13-2对细胞的毒性进行测定,运用MTT比色法来进行测定,将HEK293细胞种入到96孔的细胞培养板中,其中含有100L10%的FBSDMEM,5%的CO2,培养的时间控制在24h,在37℃下进行培养。LW13-2和Li-po2000各100L,将以上两种物质溶解在PBS中,并将配成不同比例的转染试剂加入到各细胞孔中,取4个复孔的平均值。在对照孔中培育PBS溶液,培养的时间控制在24h。将5mg/mL的MTT溶液50L加入到孔中,在37℃下培养4h,确保MTT能够还原为甲瓉,将培养板中的所有液体轻轻弃去,可见在细胞内形成甲瓉结晶。为了使甲瓉结晶能够快速溶解,需要将150L二甲基亚砜DMSO加入进去,振荡10min。使用酶标仪来测定波长吸光值,对细胞的存活率进行计算,计算方法为:细胞存活率=(试验组吸光度/对照组吸光度)。对计算结果进行分析可知,细胞存活率与细胞的毒性呈正相关关系,当细胞的存活率≥90%时,则可判定为低细胞毒性[1]

1.2.2细胞转染操作及转染效率测定

6只EP管,分别加入到EGFP质粒DNA5g中,按照阳离子转染试剂方法加入,依次加入LW13-2和转染复合物悬液,将液体放置在温室中5min,之后将事先准备好的96孔细胞加入到细胞培养皿中,完成转染实验,之后对5%CO2放置在37℃条件下继续培养,对转染效率进行计算。

1.2.3血清对基因转染效率的影响

细胞准备工作如前,按照3:1的质量比来准备转染复合物,分别加入5%、10%的复合物溶液及无血清DMEM,对液体进行轻轻混匀,将其放置在温室内,时间到达5min后,再将其加至到细胞上。

1.2.4培养时间对基因转染效率的影响

    转染复合物的质量比控制在3:1,细胞准备工作如前所示,待作用4h后,弃转染液,将含有10%的FBS加入到DMEM中,继续进行培养,培养时间为8、12、24和48h时,对细胞的生长情况进行观察,并计算出与GFP荧光细胞的比例。

2  结果

2.1细胞毒性测定

在细胞液中加入不同浓度的转染试剂,细胞培养的时间控制在24h。测定结果显示,LW13-2细胞存活率会伴随着DNA比例的增加而降低。DNA在转染复合物中的含量较少,DNA和LW13-2质量比为1:1、2:1、3:1,细胞存活率均在90%以上。将0.8gDNA和2LLipo2000,形成转染复合物,作用的时间控制在24h后,可知细胞的存活率在96.3%以上,与LW13-2的转染复合物质量相比,两者之间的细胞毒性水平较为接近,不会对细胞活力造成较大的影响。

2.2不同因素对LW13-2基因转染效率的影响

    通过显微镜进行观察,对不同比例的质粒及新型核酸载体混合物进行细胞转染,在48h后进行观察,发现细胞体内出现了明显的绿色荧光,说明这一新型的核酸载体自身具有良好的转染活性。并且荧光的强度也会随着LW13-2含量的增加而增强。转染率更高能够达到88.6%,当DNA:LW13-2为1:3时所表现出来的。转染率下降,DNA:LW13-2为1:56,导致转染率急剧下降,促使大量细胞破碎和死亡。

3  讨论

基因治疗主要是指将外源的核酸物质导入到靶细胞中,通过对阳离子脂质体细胞进行结构改良,来形成一种基因转染脂质体。通过基因与静电作用相结合,展现出了多次反复转染、大容量外源基因等特点,促进了阳离子脂质体的不断合成,促进了基因治疗新方法的诞生。

在本次实验中,通过对新型的阳离子脂质体核酸载体LW13-2进行合成,完成了对阳离子的改造和选择,增加了核酸载体细胞的靶向性,确保了基因治疗工作的发展。对转染效果的影响因素进行分析,可知质粒DNA和阳离子脂质体时重要因素,通过将两者混合,促进了脂质体的形成,核酸物质形成于囊泡结构中,避免核酸酶发生降解。在不含血清的情况下,转染效果更好,说明LW13-2在基因转染实验中取得了较好的转染效率。转染试剂Lipo2000作为一种阳离子脂质体,被广泛应用于体外基因转染中,在本次实验中,主要采用对比试剂研究的方式,对新型的阳离子脂质体核酸载体转染效率进行计算。实验结果表明LW13-2与Lipo2000具有相同的细胞毒性,细胞的整体存活率均在90%以上,DNA的转染率高于Lipo2000,两者之间差异性显著。将新型的阳离子脂质体核酸载体LW13-2应用到体外核酸转染中,展现出了较强的优势,为后续的基因治疗研究工作提供了载体系统[2]

【参考文献】

[1]尹亚军,李蕊清,刘欢,田蕾铭,张力瑞,张辉,路宏朝,张涛. 高分子聚合物对两种细胞转染效率的研究[J]. 陕西理工学院学报(自然科学版),2016,32(01):64-69.

[2]王偲颖,林靖,韩媛媛,张华,黄盛文. 阳离子脂质体介导肽核酸转染K562细胞的研究[J]. 贵州医药,2016,40(04):341-343.